20.00 求大神帮助,泛素化实验求助,转染UB-KO质粒,做IP后仍旧有条带,是怎么回事?

项目进度

  • 发布需求

    2017-10-12

  • 2

    威客交稿

    2017-11-01

    距离投稿结束时间剩余

  • 3

    雇主选稿

  • 4

    公示期

  • 5

    评价

需求描述

我打算寻找A蛋白的泛素化位点,目前已知A蛋白可以通过泛素化途径降解。通过共转染flag-A质粒与HA-ubiquitin各位点突变质粒(HA-K6,HA-K11,HA-K27,HA-K29,HA-K33,HA-K48,HA-K63,HA-WT,HA-KO),用flag抗体做IP,HA抗体检测泛素化,发现都有条带。为什么转染HA-KO,IP下来也有条带呢?是不是我的实验思路有问题?请各位大神指点迷津,谢谢!

实验如下

细胞系:HEK293细胞

转染试剂:PEI

细胞传代至10cm培养皿,待细胞融合率为80%左右,行转染,质粒总量15ug,摩尔比1:1,转染后24小时换液,44小时加MG132 20umol/l,48小时提用NP-40裂解液提蛋白,用flag抗体做IP,HA抗体检测有无泛素化。

泛素化相关质粒是其他实验室馈赠的,为了避免质粒交叉污染,我每次操作时,一次只提一个。质粒使用前送公司测过序,没有问题。


精准对接

投稿人: 周博

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