20.00 有人做过半定量PCR吗?跟荧光定量PCR有什么本质区别吗?

项目进度

  • 发布需求

    2015-08-25

  • 威客交稿

    2015-09-09

  • 雇主选稿

    2015-09-14

  • 公示期

    2015-09-10

  • 5

    评价

需求描述

有人做过半定量PCR吗?有人做过半定量PCR吗?跟荧光定量PCR有什么本质区别吗?

求解答!

精准对接
二等奖

投稿人: biotech

我以前做过半定量PCR,基本流程就是先将内参基因和目的基因同时PCR,跑电泳,得到PCR条带亮度值。之后再调整内参基因的亮度使其一致,根据内参基因的亮度计算每孔上样量。这样就能看出在内参基因一致的情况下目的基因PCR亮度的强弱,进而判断基因表达量的高低。这个实验需要的循环数要低,约25个循环左右,循环数高了就看不出差异了。如果跟荧光定量PCR比较的话,准确性不如荧光定量高。以下总结了二者几点具体的不同:

 

1 检测方式不同:半定量PCR根据PCR终产物电泳条带的亮度强弱判断起始模板拷贝数的高低或者表达量的高低,荧光定量PCR则无需电泳,可以实时监测整个PCR的过程,通过给出的Ct值及标准曲线来判断起始模板拷贝数的高低。

2 引物设计不同:荧光定量PCR如果是用Sybr Green染料法,因为荧光染料会非特异地与双链DNA结合,包括错配产物、引物二聚体等,都会产生荧光信号干扰结果,所以引物的特异性要好,并且不要形成二聚体。半定量PCR产物与引物二聚体的条带是可以区分开的,所以二聚体的影响就没么严重。

3 PCR产物长度不同:荧光定量PCR的产物不宜过长,否则会由于反应体系的过快消耗而得不到有效扩增导致结果不准确,一般要求PCR产物大小最好在70-250bp。半定量PCR看的是终产物,对于扩增长度貌似没啥要求。


三等奖

投稿人: prorevo

关于半定量PCR的实验过程2楼已经说的很详细了。

我想解释一下我对荧光定量PCR和半定量PCR本质区别的理解。

PCR反应是一个指数扩增过程,就是每经过一个循环分子数1个变2个,2个变4个,4个变8个的翻倍关系。但是随着反应的进行,体系中引物,模板,酶的消耗,使反应无法形成完美的指数扩增曲线,即产物不随着循环数的增加而翻倍了,而是一条S形曲线,也就是PCR反应存在平台期,随着循环数的增加,PCR产物达到了极限,不再增加了。

而我们常说的半定量PCR实际上就是一个终点检测法,他是假设两个反应的效率一致,且都按照指数扩增的倍增方式进行反应,从而根据最终得到PCR产物的多少来推测起始模板的量,比如我们将条件设置25个循环,但我们根本就无法预测在25个循环之前整个PCR体系是否处于完美的指数扩增时期,只有反应符合指数扩增的方程,我们才能用最终的反应结果PCR产物达到多少来推断模板量的多少,否则这种假设就不成立。因此现在已经很少有文献用半定量PCR的方法来证明基因表达量的差异了,因为这个方法不是很准确。

而荧光定量PCR则不同,他不是在平台期监测反应,而是在反应的起始阶段的指数扩增期来监测反应,注意,这里是反应的起始阶段,就是酶,模板,引物等还十分富裕的时期,此时PCR反应是处于指数扩增阶段的,荧光定量PCR就是检测这个时期的反应,并利用CT值来确认反应的起始模板的量。CT值是反应达到荧光阈值的循环数。 也就是说达到阈值时的循环数越多,说明反应的起始模板量越少,循环数越少,反应的模板量越多。因此现在发文章多数利用荧光定量的方法替代半定量的方法了。

以上观点希望对您的理解有帮助。 


三等奖

投稿人: doctor_vivian

半定量PCR是RT-PCR,荧光定量PCR是realtime-PCR。

都是用来检测基因的转录翻译水平的高低,也就是检测mRNA的水平,

因此都是先提取RNA,然后都要先反转成cDNA再用。

但是RT-PCR需要先扩增,然后跑水平琼脂糖胶电泳,跑出来条带,通过比较条带的亮暗来反映mRNA的高低,有点类似于western结果的比较;

而real-time-PCR直接扩增出结果,一步完成,通过得出的数值来比较mRNA水平高低。


淘汰

投稿人: 锐赛生物

一个是PCR,一个是QPCR。它们的区别相当于QPCR有水龙头,可以控制水量,快慢,大小。而PCR只能给你一桶水。我是这样理解的,仅供参考。

淘汰

投稿人: 魏凯320722

我以前做过半定量,现在很少用了。半定量操作相对要简单一些,半定量和荧光定量的本是区别是在与对模板的定量的原理不同。半定量PCR是根据PCR终产物条带的亮度来比较起始模板的数量多少,不具有实时监测的作用,因此准确性要低一些。实时定量荧光PCR由于在反应体系中加入荧光物质,所以在反应过程中可以随时根据荧光的亮度监测模板的数量,准确性要高。这两种方法要根据具体的实验要求来选择,还有你要发的文章的质量,好文章一般是要求要做实时荧光定量PCR的。希望能帮到你。

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