10.00 超表达载体构建

项目进度

  • 发布需求

    2018-04-01

  • 威客交稿

    2018-04-21

  • 雇主选稿

    2018-04-26

  • 公示期

    2018-04-26

  • 5

    评价

需求描述

求助:1 超表达载体构建引物如何设计,2 目的基因的CDS序列有五千多,反转录后会不会碱基缺失或者突变,我之前用CDS序列前后数了15个碱基作为引物,之后连接T载测序发现片段中间缺失了几十个碱基,是不是我方法有问题,求各路大神帮忙解答。谢谢

精准对接
一等奖

投稿人: phoenix

您无权查看 !

一等奖

投稿人: maolanlan

您无权查看 !

投稿人: BiomedHKU

附件:

你用了目标基因CDS序列的前后15个碱基作为Primer, 克隆出了你的目标片段,说明Primer是OK的。克隆出的产物中间有缺失碱基,有以下几个原因:


  1. 你用的PCR酶是否是高保真的,5kb的长度的确比较长,容易出错,一定要选择高保真的酶。

  2. 也有可能是你PCR cycle太多了,cycle越多,出错的概率也就越大,一般建议不要超过25个cycle。

  3. 会不会是测序有问题呢,本人之前遇到一次测序出错了,反复验证后发现质粒序列本身没有任何问题。Sanger Sequencing的精度一般在600-1200bp左右,你这个5kb的产物真的比较大,要设计很多条引物才能完全测通,建议在你缺失的那部分上下游500bp的位置分别设计一条正反Primer重新送去测序,排除测序的问题。

  4. 还有就是最基本的问题,仔细通过网站确定CDS的序列,不要是你PCR出来的是对的,而你原先找的序列是不对的。

  5. 做overexpresison,如果能购买到别人构建好的质粒直接从质粒上克隆你要的序列,就非常容易,也不太会出错。


Primer设计的话建议在网站IDT在线设计,也可以分析Primer的优劣,很方便的。更多问题可以微我

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