10.00 蛋白上样量指的是每个孔的上样蛋白浓度吗?

项目进度

  • 发布需求

    2018-04-15

  • 2

    威客交稿

    2018-05-05

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  • 3

    雇主选稿

  • 4

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需求描述

请问大神,蛋白上样量指的是每个孔的上样蛋白浓度吗?

还有一个问题,在电泳恒压时,为什么跑着跑着变成了恒流,而恒流转膜时,电压却一直上不去,设置的120mA恒流,电压一直在34V左右,这是为什么呀,是因为缓冲液的问题吗,每次都是新配的,是买的10x的缓冲液,直接稀释后用的。


精准对接

投稿人: 夏布忍冬

附件:

你好,请问你询问的是western lot实验中的蛋白上样量吗?一般指的是每个孔的样品的蛋白总量。例如,你测得的样品蛋白浓度为2μg/μl,如果要上总蛋白30μg,则需要你的样品15μl。WB实验中要求每个孔的上样量一致,所以如果单个蛋白样品浓度不一致的话,所上的样品体积就不一样,因此需要用1X的上样buffer 补齐上样总量。

比如有三个样品,总上样量为30μg,计算上样体积(例1):

上样之前,把样品和1x buffer在EP管中先混合均匀,然后统一点样。

投稿人: xli13

首先,western每个孔蛋白的上样量指的是蛋白的质量,即每孔保持相同的蛋白质量;同时,也要保证每孔的体积一样,这样跑出来的条带才会一致,而且非常漂亮。因为浓度的不同,上相同质量的蛋白时体积肯定是不同的,这时用裂解液和loading buffer补充(注意是和不是或),即保证每个空的loading buffer都是一样的量,剩下的用裂解液补充即可。 你会发现每次跑的条带特别整齐且非常漂亮。


关于电压为什么跑着跑着变成恒流了,我也遇到过类似的问题,这个和缓冲液还有电泳仪有关,但不用特别纠结,每次用新的缓冲液转膜,尽量不要用回收的。

转膜时电压上不去很正常,我一般200mA恒流时,电压在140v左右,但是后期慢慢会降,不必纠结。


总结一下,第一,跑胶时每孔上同样质量的蛋白且保证同样体积;第二,不必纠结转膜时电压为何上不去,本身就是放热的过程,但转膜时尽量用新的转膜液。

补充一下,小蛋白(30kDa一下)尽量低电流短时间转膜,否者会跑出去,0.22PVDF膜或NC膜,最好封闭过夜;大蛋白可以时间长一些,但要自己摸索时间。

投稿人: 思雨

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