20.00 ​求助!精子RNA提取问题

项目进度

  • 发布需求

    2018-05-07

  • 威客交稿

    2018-05-27

  • 雇主选稿

    2018-06-01

  • 公示期

    2018-06-01

  • 5

    评价

需求描述

我最近提精子RNA浓度可以但 A260/A280比值一直上不去,一般在1.5-1.65之间,这是什么问题,求各位大师指导?操作步骤如下:

1、将冷冻精子从液氮罐中迅速取出后,在37 °C水浴锅上30S内解冻到1.5mL无RNA酶的离心管中(样品量160ul),4°C条件下1000 r/min离心3 min,弃上清。

2、用DEPC处理过的预冷到4°C的PBS缓冲液洗涤沉淀两次,1000 rpm/min离心3min,弃上清。

3、向沉淀中加入1ml的Trizol,祸旋震荡,在室温下静置5 min。

4、向离心管中加入20 uL β-硫基乙醇,混勻,65°C,水浴30 min,取出后冰浴1 min.。

5、向离心管中加入0.2 mL的氯仿,手动用力震荡15s,室温孵育10min,12000 rpm 4 °C离心15min。

6、离心后溶液分为三层,小心吸取上层水相2/3至新的无RNA酶的离心管中。

7、二次氯仿抽提蛋白

8、向离心管中加入等体积的异丙醇,轻轻反复颠倒混勻,室温静置lOmin, 12000 rpm离心10 min。

9、离心后试管底部会出现沉淀,此为提取出来的RNA。小心弃去上清,缓慢的沿离心管壁加入DEPC水配制的75%的乙醇1 mL,切勿触及沉淀,轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁,12000 rpm 4 °C离心5 min后小心弃去乙醇。

10、室温干燥燥沉淀8-10 min,使乙醇完全挥发,用30ulDEPC处理的水溶解沉淀后,于-80 °C保存备用。


精准对接
一等奖

投稿人: 科研扫地僧

您无权查看 !

三等奖

投稿人: 包子

RNA A260/A280小于1.8,一般是蛋白质或者酚类物质污染。您的protocol没有问题,但是在离心分三次后,吸上清时不要贪多,尽量少一点。祝您成功!

显示 1~2 项 共 2 个投稿

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